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　　文库构建的本质是将片段化后的基因组DNA两端加上通用接头序列，通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的文库核酸分子。根据样本类型，又分为DNA建库和RNA建库

　　高通量测序又称下一代测序技术(Next-generation Sequencing, NGS)，相对于第一代DNA测序技术（Sanger法），它可以同时对几十万乃至数百万条核酸分子序列进行测定，具有通量高、成本低、规模大等显著优势，应用范围非常广泛，目前已经成为全球主流测序技术。

　　由于目前市场中测序仪的测序长度通常在150-500bp之间，因此需要使用机械打断或酶切打断的方法将大片段基因组DNA片段化为小片段的DNA。机械打断的方式对样本的损耗相对较高，操作方式也更为复杂，市面上也常用酶切的方式对基因组DNA进行打断。与机械法相比，酶切法的成本更低，操作更简便，加入片段化酶后仅需反应一段时间即可。 目前常用的片段化酶主要有两种，一种是基于转座子原理的Tn5转座酶，另一种是核酸内切酶的混合酶，但是这些片段化酶的效果容易被样本GC含量、碱基偏好性所影响。与此相比，翌圣研发的片段化酶(Yeasen Cat#12917)酶切效果稳定，偏好性远低于Tn5转座酶，针对不同的DNA类型样本（包括FFPE样本）都有优异的测序结果。

　　不论真核生物还是原核生物，其RNA中最多的是rRNA，其占比高达80%。如果直接对样本的总RNA进行测序，测序数据中绝大部分将为rRNA的相关数据，因此必须通过RNA富集的方法去除rRNA的干扰。RNA富集的方法有基于oligo-dT富集的mRNA方法和rRNA去除法。 线;端具有明显的poly(A)的结构特点，利用Oligo(dT)磁珠可以富集样本转录出来的所有mRNA，从而进行转录本的分析，适用于高质量的RNA样本。而rRNA去除的方法对样本质量的要求要低于mRNA测序，同时适用于低质量(如FFPE样本)和高质量RNA样本，也适用于原核生物类型样本，商业常用RNase H消化的方法去除rRNA。具体步骤如下：

　　将获取的目的RNA反转录成cDNA第一条链。因为RNA极易被环境中存在的RNase降解，在反转录过程中使用RNase Inhibitor(Yeasen Cat#10603)可以抑制这些酶的活性，保护RNA不被RNase降解。与此同时，使用逆转录酶(Yeasen Cat#11112)将模板RNA反转录成cDNA；逆转录酶具有依赖RNA的DNA聚合酶活性，能够以RNA为模板，按5→3方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，也就是cDNA第一链。

　　反转录合成的单链cDNA极不稳定，需立即在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第二链。在二链合成时，RNase H可以除去RNA-DNA杂合链中的RNA链，配合DNA聚合酶Ⅰ (Yeasen Cat#12903)催化合成cDNA第二链。DNA聚合酶Ⅰ 具有5→3 DNA聚合酶活性，可在模板和引物的作用下，沿5′→3′方向合成与cDNA一链互补的序列。 后续流程分别为末端修复、3端加“A”、接头连接、PCR富集，这些在DNA文库构建中已有列举，这里不再多做赘述。需要注意的是，当反转录完成以后，不需要再次打断核酸片段。 翌圣生产多种NGS建库相关的酶，您可以使用下表，选择最适合的文库构建产品。